Приведенные здесь схемы ДГГЭ обеспечивают более высокую разрешающую способность и эффективность обнаружения мутаций за счет использования гетеродуплексов. Их основные этапы приведены на рис. 4. Исследуемые препараты ДНК отжигают с меченым одноцепочечным ДНК-зондом, и если в них произошла замена нуклеотида, образовавшийся гетеродуплекс будет иметь однонуклеотидный неспаренный участок. Далее проводят электрофорез в денатурирующем геле с последующей радиоавтографией, используя в качестве контроля гомодуплекс ДНК дикого типа. Таким образом, в этом случае не требуется стадии блотинга геля. Кроме одноцепочечных ДНК-зондов можно использовать асимметрично меченные двухцепочечные ДНК-зонды, а также меченые одноцепочечные РНК-зонды для тестирования ДНК в гибридах РНК–ДНК или РНК в РНК–РНК-гибридах.

С помощью ДГГЭ, также как и при РНКазном расщеплении, можно исследовать фрагменты нуклеиновых кислот длиной от 100 до 1000 п.н. Верхний предел значений длин в некоторой степени определяется необходимостью использовать полиакриламидный гель. Подвижность в нем фрагментов ДНК длиной более 1000 п. н. резко снижается, а это значительно увеличивает время, необходимое для их электрофоретического разделения. Еще более серьезную проблему представляет собой характер плавления длинных фрагментов. Известно, что чем длиннее фрагмент, тем. больше в нем доменов плавления. При прохождении такого фрагмента через гель очень быстро наступает резкое снижение его подвижности, обусловленное плавлением одновременно большого числа доменов, что делает доступной для обнаружения замены лишь незначительную часть длинного фрагмента. В силу вышеуказанных причин мы стараемся работать с фрагментами, длина которых не превышает 1000 п. и. Поскольку для большинства фрагментов ДНК более половины их длины приходится на легкоплавкие домены, то денатурирующий электрофорез фрагмента в 1000 п. и. позволяет тестировать на нуклеотидные замены примерно 500 нуклеотидов. Для повышения информативности анализа можно использовать ДНК-зонд длиной 1000–2000 п.н.; отжигать его с геномной ДНК, обрабатывать соответствующими рестриктазами и получать при этом два-три фрагмента оптимального размера.

Таблица 1. Сравнительная характеристика методов градиентного анализа ПДРФ, рестриктазного расщепления и денатурирующего гель-электрофореза


Это интересно:

Биотические факторы среды
Видовое разнообразие биоценозов . Каждый живой организм живет в окружении множества других, вступая с ними в самые разнообразные отношения как с положительными, так и с отрицательными для себя последствиями, и в конечном счете не может с ...

Основа организации и устойчивости биосферы
Термин "биосфера" был введен для обозначения общего облика поверхности Земли, обусловленного наличием на ней всей массы живых организмов. Два главных компонента биосферы — живые организмы и среда их обитания (включая нижние слои ...

Влияние теплопродукции
У гомойотермных животных при снижении температуры окружающий среды температура ядра поддерживается на стабильном уровне, поскольку часть принимаемой энергии превращается в тепловую энергию ...