Выделение митопластов из митохондрий печени крыс

Для одного выделения обычно декапитировали 10 крыс, у которых извлекали печень.

Печень измельчали в специальном прессе, затем гомогенизировали в десятикратном объеме 300 мМ раствора сахарозы в 10 мМ Tris-HCl, рН 7.4 с использованием автоматического гомогенизатора при 240 об/мин.

Далее гомогенат центрифугировали на центрифуге К-70: 4 мин при 1200 об/мин (400g), затем 6 мин при 1500 об/мин (600g). В этих условиях осаждаются ядра и мембранные структуры.

Супернатант центрифугировали на РС-6 20 мин при 4800 об/мин (3500g). В этих условиях осаждается митохондриальная фракция. Осадок собирали и промывали в 300 мМ раствора сахарозы в 10 мМ Tris-HCl рН 7.4, затем ресуспендировали.

Повторное центрифугирование проводили на РС-6 20 мин. при 4800 об/мин (3500g). Осадок собирали, мерили его объем.

Доводили полученные митохондрии Tris-HCl (10 мМ, pH 7.4) до 500 мл.

Оставляли при перемешивании и температуре 4°С на 30 мин. В результате получались митопласты.

Митопласты центрифугировали при 5500 об/мин на РС-6 (4000g) в течение 20 мин.

Осадок объединяли. Измеряли его объем и концентрацию белка. Концентрацию белка измеряли спектрофотометрически (длина волны 750 нм) по методу Лоури (Лоури, 1965). Исходя из полученных данных, митопласты разводили бидистиллированной водой до концентрации 44 мг/мл.


Это интересно:

Введение. Понятие биосферы
Существуют два основных определения понятия биосфера», одно из которых известно со времени появления в науке данного термина. Это понимание биосферы как совокупности всех живых и неживых организмов на Земле. Биосфера (от греч. bios — жиз ...

Задания. Экскурсия «особенности строения придорожных растений»
Внимательно осмотрев особенности строения всех органов растущего подорожника большого, я проделала с ним несколько опытов. 1. Испытала лист и черешок на разрыв. Разорвать удалось не сразу. Сначала лист деформировался и растянулся, а уже ...

Становление современных фаунистических областей
Кайнозойская эра. Несмотря на небольшую продолжительность кайнозойской эры (60-70 млн. лет), ископаемые свидетельства об энтомофауне этого времени наиболее полны. Изменения климата. Современная физическая картина земной поверхности сфор ...