Определение проводимости бислойных липидных мембран (БЛМ)

Электрическая часть прибора для измерения проводимости бислойных липидных мембран представляет собой амперметр, измеряющий силу тока при определенной разности потенциалов между электродами. Сила тока зависит от проницаемости (сопротивления) мембраны, разделяющей раствор электролита в кювете. Исходя из этого, можно определить проводимость мембраны (проводимость = 1/ сопротивление).

Проводимость билипидного слоя очень близка к нулю (10-12 пСм) при умеренном напряжении. Абсолютное значение напряжения более 150 мВ «рвет» билипидный слой.

Проводимость отличная от нуля определяется белками, встроенными в билипидный слой.

Проводимость нелинейно зависит от напряжения (в случае БЛМ), поэтому определяется проводимость при различных напряжениях.

Подготовка кювет: до и после работы кюветы отмывали детергентами, затем 10-15 минут споласкивали в струе воды (в стакане). Промывали дистиллятом, протирали спиртом, промывали дистиллятом от спирта. Ставили сушиться. Когда кюветы высыхали, смазывали отверстие в меньшей кювете липидами снаружи и внутри и давали высохнуть. Вставляли меньшую кювету в большую. Наливали в каждую кювету по 1 мл среды.

Среда для БЛМ: 3 M KCl; 20 мМ Tris, pH 7.4.

Приготовление липидов: 20 мкл общих липидов мозга и 26 мкл кардиолипина (Blight et al., 1959). Смесь близка по составу к митохондриальным липидам.

Затем эту смесь сушили аргоном, чтобы испарился хлороформ и метанол.

В пробирку с высушенными липидами добавляли 80 мкл н-декана, чтобы растворить липиды перемешивали.

Работа на приборе: наливали в каждую кювету по 800 мкл буфера; вставляли два электрода в кюветы; включали приборы; наносили липиды на отверстие в меньшей кювете, используя микроскоп. Ждали, пока цветная (полислойная) мембрана станет черной (бислойной).

В одну из кювет (обычно транс-) добавляли необходимое количество белка, а в другую (цис-) такое же количество среды для БЛМ, причем с расчетом, чтобы содержание KCl в обеих кюветах было изоосмотическим.

В случае появления проводимости, ее регистрировали две-три минуты, затем меняли напряжение, и ингибировали проводимость АТФ.


Это интересно:

Биосферный цикл азота
Цикл азота - пример сложного круговорота газообразных веществ, способных к быстрой саморегуляции. Схема цикла может быть представлена следующим образом: Атмосферный азот связывается при разрядах молний и в результате жизнедеятельности аз ...

Выводы
1. Экспрессия белков клеточного цикла и Cdk 5 имеет различный уровень в исследованных отделах мозга и зависит от функционального состояния сусликов. 2. Температура тела сусликов влияет на экспрессию белков клеточного цикла и Cdk 5 в коре ...

С\х загрязнение окружающей среды пестицидами и минеральными удобрениями
Загрязнение пестицидами : Для повыш урожая и кач-ва с\х к-р, борьбы с сорняками, возбудителями болезней примен-ся защита раст с использованием: агротехнич. метода, селекционного, биологического, химического. Наибольш. опасность для жив пр ...