Нативный электрофорез
При нативном электрофорезе не используются детергенты, белки разделяются как по заряду, так и по молекулярной массе. При обнаружении (возможном) не одной, а нескольких полос (загрязнение) проводится элюция с геля всех полос, затем белки идентифицируются на SDS-форезе.
Концентрированный буфер для элюции (рН=8.8): 3г Tris на 500 мл воды; 14.4 г глицина на 500 мл воды.
Буфер для элюции: концентрированный буфер развести в 10 раз.
Приготовление гелей: сведения представлены в таблице 4.
Таблица 4. Приготовление гелей для нативного электрофореза.
10% гель: |
2.5% гель: |
30% акриламид – 3.3 мл |
30% акриламид – 0.5 мл |
1% бис-акриламид - 1.3 мл |
1% бис-акриламид – 0.5 мл |
1.5 М трис (рН=8.7) – 2.5 мл |
0.5 М трис (рН = 6.8) – 1.25 мл |
вода - 2.73 мл |
вода – 2.67 мл |
персульфат аммония - 0.035 мл |
персульфат аммония - 0.025 мл |
ТЕМЕД – 0.003 мл |
ТЕМЕД – 0.0025 мл |
Пластинки заливали рабочим буфером для фореза. Проводили префорез: 30 мА 30 мин.
Бромфеноловый синий в кислой среде бурый, при рН 8.3 синеет. Краску наносили на гель ровным слоем и устанавливали силу тока 30 мА на 1 мин, чтобы краска вошла в гель.
Добавляли сахарозу и глицерин для увеличения плотности раствора. В краску тоже добавляли сахарозу.
Когда краска входила в гель, наносили пробу ровным слоем. Устанавливали силу тока 30 мА (примерно на 3 часа).
После этого, вырезали боковые части геля, окрасили их 30 минут бромфеноловым синим, отмывали в 7.5% уксусной кислоте. Вырезали полосу геля, соответствующую полосе белка (должна быть чуть шире, чем полоса белка), измельчали, помещали в трубку для элюции.
Пробирки заполняли буфером, потом заливали буфер в верхнюю камеру, чтобы покрыло пробки. В наружной камере буфер должен покрывать мембрану.
Камеру ставили в холодильник, проводили элюцию при 8 мА (для двух трубок) 12 часов. Доэлюцию (если было необходимо) проводили при 10 мА 1 час.
После этого, сливали буфер из внутренней камеры во внешнюю. Из трубок пипеткой вытягивали буфер. Аккуратно снимали пробку – в ней препарат. Осторожно, чтобы не повредить мембрану, вытягивали пипеткой элюат.
Это интересно:
Приложения
Приложение 1
Радиальная скорость роста исследуемых штаммов, мм/ч
Источники углерода
Продолжительность экспозиции, ч
48
96
168
216
288
336
A. niger
лактоза
0,45
0,21
0,1
0,3
0,1
0,04 ...
Атерогенез
Многие исследователи отмечают, что необходимым условием атерогенеза является повреждение стенки сосуда, что приводит к секвестрации и накоплению в интиме фагоцитирующих клеток с последующим их перерождением в «пенистые» клетки. Тот факт, ...
Характеристика оз.
Виштынецкого
Сувалкская возвышенность - озерный край, расположенный на юго-восточной границе с Польшей и Литвой. |Подлинной жемчужиной края, несомненно, является самое большое и красивое озеро - Виштынецкое. Необычайно большая глубина (54 м) и значите ...